Chapter II Sterile Technique And Agar Culture
ГЛАВА 2
СТЕРИЛЬНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ И РАБОТА С АГАРОМ
(Перевод CHAPTER II STERILE TECHNIQUE AND AGAR CULTURE из книги Пола Стаметса “The Mushroom Cultivator”)
перевод подготовил synthmax
Воздух которым мы дышим подобен живому океану кишащему микроскопическими организмами, он колышется приливами и отливами от малейшего дуновения ветерка. Плесени, бактерии, вирусы и растения используют атмосферу для распространения своего потомства в новые ареалы обитания. И если не предпринять определённые меры предосторожности, то эти микрочастицы могут сделать поддержание стерильности технологии затруднительным, однако если вам удастся пресечь или сильно сократить движение этих организмов в воздухе, то в успехе стерильной технологии можно быть практически уверенным.
Существует пять основных источников заражения при работе с грибной культурой:
1. Непосредственно окружающая среда (воздух);
2. Субстрат (носитель культуры);
3. Инвентарь для культивации;
4. Сам культиватор (грибовод) и его или её одежда;
5. Споры грибов или мицелий.
Грибы как и вообще все живые организмы постоянно конкурируют друг с другом за доступные питательные вещества. Создавая стерильные условия, вы просто даёте грибной культуре значительные преимущества перед несметным множеством других конкурентов. Пред тем как начать работу непосредственно с культурой, первым шагом будет изготовление камеры для инокуляции или оборудование стерильной лаборатории.
ПРОЕКТИРОВАНИЕ И ОБУСТРОЙСТВО СТЕРИЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Большинство грибоводов терпят неудачу в своих начинаниях только из-за того, что не удосуживаются оборудовать место для стерильной работы. Хотя всё что может для этого потребоваться это полдня работы по переоборудованию стенного шкафа или кладовки в приемлемую лабораторию для инокуляций.
Начните с того что уберите все коврики, шторки и прочие тканно-вязаные изделия в которых скрывается большое количество пыли и спор. Тщательно вымойте полы, стены и потолки с мягким дезинфектантом. Если вы покрасите помещение глянцевой белой эмалью, это упростит уборку в будущем. Закройте все окна и другие источники потенциальных сквозняков листовым пластиком. Либо с внешней, либо с внутренней стороны сконструируйте тамбур, который будет служить защитным шлюзом. Такая система будет выполнять роль защитного буфера между внешней средой и лабораторией. Тамбур следует организовать таким образом чтобы одна дверь могла бы оставаться закрытой, когда открывается другая дверь. Укомплектуйте лабораторию следующими предметами:
1. стул и устойчивый стол с гладкой поверхностью;
2. пропановая горелка, спиртовка или бутановая зажигалка;
3. чётко помеченный пульверизатор с 10% раствором гидрохлорида натрия (белизны);
4. стерильные чашки Петри и пробирки;
5. самоклеющиеся листочки (или лейкопластырь), блокнот, ручка и нестираемый маркер;
6. нож для агара (скальпель) и инокуляционная петля.
Все эти предметы должны всегда оставаться в лаборатории. Если что-то из этого было вынесено, перед возвращением убедитесь в абсолютной чистоте предмета.
Поддерживать в лаборатории условия близкие к стерильным можно простой тщательной уборкой с частотой зависящей от частоты использования помещения. Степень тщательности будет зависеть от насыщенности воздуха спорами в вашем конкретном случае. В зимний период объём свободно перемещающихся спор радикально снижается, тогда как весной и летом можно заметить очевидный рост этого объёма. Следовательно в эти периоды пикового роста количества контаминантов потребуется бОльшая тщательность в уборке. Ещё более важно выносить из лаборатории все заражённые банки и чашки Петри способом не представляющим угрозы для стерильности лаборатории.
Завершив обустройство лаборатории необходимо строго и неколебимо блюсти в ней жёсткую гигиену. Помещение следует мыть с дезинфектантом, полы с шваброй и напоследок распылять 10% раствор белизны из пульверизатора. После распыления в лабораторию нельзя входить в течении 15 минут, пока не осядут все взвешенные в воздухе частицы. Вы ДОЛЖНЫ проводить весь комплекс гигиенических процедур перед каждой инокуляцией. Запомните как правило: заражение проще предупредить, чем уничтожить после появления.
Прежде чем продолжать, необходимо напомнить об осторожности. Стерильная работа требует концентрации, внимания к деталям и твёрдости руки. Работайте в пределах разумных промежутков времени, а не до полного изнеможения. Никогда не оставляйте без присмотра спиртовку или бутановую горелку и всегда помните о том что в замкнутом пространстве очень быстро заканчивается запас кислорода.
Некоторые грибоводы выводят войну с контаминантами за пределы разумного и иногда даже во вред собственному здоровью. Начинают «бойню» в лаборатории, накачивая её токсичными фунгицидами и бактерицидами, подвергая себя воздействию чрезвычайно опасных химических веществ. Вот был случай, когда лаборант вошёл в помещение основательно накачав его гермицидом на основе фенола (карболовой кислоты). Из-за высокой концентрации яда он потерял чувство опасности и через несколько минут испытал сильное затруднение дыхания, онемение конечностей и конвульсии. Эти симптомы продержались несколько часов и он полностью не восстановился даже через несколько дней. А вот ещё был случай, один человек установил в главбоксе коротковолновую ультрафиолетовую (кварцевую) лампу и проводил инокуляции голыми руками в течении месяца даже не подозревая об опасности. Источник света такого типа может вызвать рак кожи после продолжительного воздействия. Существуют альтернативные способы и средства не причиняющие или причиняющие незначительный вред здоровью и позволяющие бороться с контаминантами также, а иногда и более эффективно.
Если не смотря на все ваши сверхусилия сохраняется высокий уровень контаминации, есть несколько дополнительных способов повышения стерильности. Первый, самый простой и недорогой, использует коллоидный раствор лёгкого масла распыляемый в воздухе лаборатории; второй включает в себя изготовление камеры с неподвижным воздухом, т.н. главбокс (glovebox – ящик с перчатками); а третий относительно дорог, т.к. требует использования высокоэффективных микронных фильтров.
1 – При распылении стерильного масла создаётся облако крайне вязких, маленьких капель. По мере оседания оно связывает все находящиеся в воздухе частицы. В этом способе используется триэтиленгликоль испаряемый с поверхости подогреваемого тампона. Мелкодисперсный и более летучий чем минеральное масло, триэтиленгликоль не оставляет сколько-нибудь заметной масляной плёнки. Использование триэтиленгликоля не отменяет стандартные меры по поддержанию гигиены.
2 – Главбокс – это воздухонепроницаемая камера, которая предоставляет условия для создания стерильной среды в которой и проводится работа с культурами. Простейшая конструкция представляет собой ящик из фанеры, со смотровым окошком. В отверстиях для рук закрепляются перчатки, в которые вставляются руки. Иногда вместо перчаток передняя часть ящика прикрываются сменной хлопковой тканью, которую следует периодически стерилизовать. Главное преимущество главбокса заключается в том что он, являясь уменьшенным в масштабе и недорогим подобием лабораторной комнаты, предоставляет удобный для чистки объём, в котором нет или почти нет движения воздуха и можно спокойно работать со стерильными культурами.
3 – Современные лаборатории решают проблему инфекциии переносимой по воздуху установкой высокоэффективных воздушных фильтров частиц (high efficiency particulate air (HEPA) filter). Эти фильтры задерживают все частицы диаметр которых превышает 0,1–0,3 микрона, т.е. меньше любых спор грибов и практически всех бактерий. HEPA-фильтры встраиваются в т.н. ламинарные шкафы. В некоторых стерильных лабораториях из HEPA-фильтров набирается целиком герметичная стена или потолок и через них подаётся внешний воздух. В результате внутри лаборатории создаётся позитивное давление, которое не даёт проникнуть нестерильному воздуху. Устройство и типы ламинарных шкафов подробно обсуждаются в приложении IV.
У некоторых культиваторов практически не возникает проблем, при том что они работают в казалось бы совсем примитивных условиях. Другие испытывают явные проблемы с постоянными заражениями и им приходится вкладываться в высокотехнологичные устройства контроля окружающей среды. Каждые конкретные условия вынуждают принимать определённые контрмеры. И независимо от того выращиваете ли вы грибы дома или организовываете работу лаборатории, вы испытаете одинаковые трудности отличающиеся лишь в масштабах.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРА
Завершив обустройство стерильной лаборатории следующим шагом можно приступать к приготовлению питательного носителя на основе агара. Агар – это вырабатываемое из морских водорослей студнеобразующее вещество наподобие, но несколько более эффективное чем желатин. Существует много рецептов приготовления обогащённых агаровых носителей пригодных для разведения грибной культуры. Стандартными можно считать картофельный (Potato Dextrose Agar (PDA)) и солодовый (Malt Extract Agar (MEA)) агары, которые нередко дополняют дрожжами в качестве питательной добавки. В микологических журналах часто упоминаются агары на пептоне и неопептоне – два самых доступных источника протеина для грибного мицелия. Есть ещё один тип агара, который авторы рекомендуют, на бульоне от варки ржи или пшеницы с добавлением солодового сахара (или мальтоза – дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы).
Если вы испытываете трудности связанные с инфицированием бактериями, то добавление антибиотиков в питательный носитель предотвратит их размножение. Большинство антибиотиков, таких как стрептомицин, разрушаются в процессе автоклавирования и поэтому их следует добавлять в агар после стерилизации пока он жидкий. Один антибиотик, сульфат гентамицина, выдерживает автоклавирование и эффективен против широкого круга бактерий. Антибиотики негативно влияют на мицелий некоторых видов грибов.
Десятки обогащённых агаровых сред были успешно использованы для культивации грибов и у каждого грибовода складываются свои предпочтения основанные на личном опыте. Независимо от типа используемой агаровой среды, важнейшей её характеристикой является pH – логарифмическая шкала отмечающая уровень кислотности или щёлочности в диапазоне от 0 (кислота) до 14 (щелочь), где 7 нейтральный уровень. Различные виды Psilocybe предпочитают носитель сбалансированный между 6,0–7,0, тогда как Agaricus brunnescens и близкие к нему лучше растут в нейтральной среде. По большей части мицелий достаточно терпелив и хорошо растёт в промежутке 5.5–7.5 pH. О показателе pH стоит беспокоиться только тогда, когда на носителе не прорастают споры или рост мицелия чрезвычайно замедлен.
Ниже приведены несколько формул сбалансированных питательных сред обогащённого агара, в высшей степени пригодных для выращивания мицелия видов Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Stropharia, Lepisia, Flammulina, Volvariella, Panaeolus и Psilocybe. Из приведённых формул авторы предпочитают две: PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами – Potato Dextrose Yeast) и MPG (зерновой с солодом и пептоном – Malt Peptone Grain) агаровые составы. Добавлением в любому составу молотой ржи или зернового экстракта можно добиться преобладающего роста нитевидного мицелия, т.е. наиболее предпочитаемого за его быстрый рост.
Выберите формулу, смешайте ингредиенты в сухом виде, поместите всё в мерную чашку и добавляйте воду пока не получите литр состава.
PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами) агар
300 гр картофеля кипятить час в литре воды, отфильтровать
10 гр декстрозы (глюкозы)
20 гр дрожжей
20 гр агара
MEA (агар на солодовом экстракте)
20 гр желто-коричневого солода
2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара
(избегайте использования тёмного пивного карамелизованного солода, требуемый солод именно светлого, слегка подрумяненного цвета, более сыпучий и нелипкий)
MPG (агар зерновой с солодом и пептоном)
20 гр желто-коричневого солода
5 гр молотых зёрен ржи
5 гр пептона или неопептона
2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара
Для здерживания роста бактерий на каждый литр воды до стерилизации можно добавлять 0,1 гр 60–80% сульфата гентамицина (см. Приложение VII).
Качество воды, её pH и минеральный состав отличаются в зависимости от региона. Если качество вашей воды находится под сомнением, рекомендуем использовать дистиллированную воду. Для практических нужд, тем не менее, сгодиться и вода из водопровода без особого вреда для мицелия. В некоторых случаях сбалансированный уровень pH важен, например для проращивания спор или разведения мицелия экзотических видов грибов. Изменить pH носителя можно добавляя в него по капле соляной кислоты (HCL) или каустическую соду (NaOH). Затем основательно перемешав состав, нужно снова измерить его уровень pH. (pH соляной кислоты – 0; pH каустической соды – 12; pH дистиллированной воды – 7).
Тщательно смешав все ингредиенты стерилизуйте состав в скороварке в течении 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi). (Скороварка является безопасным и эффективным средством стерилизации субстратов при условии использования строго в соответствии с инструкцией производителя). Для автоклавирования агара рекомендуем использовать колбу с узким горлом. Если у вас нет специально приспособленного для этого сосуда, подойдёт любая похожая по форме бутылка. Обязательно заткните горлышко ватным тампоном и прикройте сверху фольгой до помещения в скороварку. Колбу можно наполнить только на 2/3–3/4 от полного объёма.
Наполненный сосуд поместите в скороварку налив достаточное для образования пара количество воды. (Обычно достаточно 1 см от дна). Приведите скороварку в рабочее состояние следуя инструкции производителя. Поставьте её на огонь и дождитесь появления густой струи пара. Выждав 4–5 минут закройте паровой клапан. Медленно поднимите давление до 1,05 ат (15 psi) и поддерживайте его в течении получаса. Не позволяйте температуре подниматься выше 121°C, в противном случае сахар в агаровой среде карамелизуется. Карамелизованный сахар в носителе подавляет рост мицелия и повышает вероятность генетических мутаций.
В лаборатории следует иметь стерильную тряпичную ухватку или кусок свежевыстиранной ткани для удобства обращения с горячей посудой с агаром. Пока стерилизуется носитель вымойте лабораторию до безупречной чистоты.
Время необходимое для стерилизации разнится в зависимости от высоты над уровнем моря. В неизменном объёме существует прямая зависимость между давлением и температурой (известная как закон Бойля-Мариотта). Когда рекомендуется определённое давление (равно как и температура), оно основано на стандартной высоте над уровнем моря. Культиваторам проживающим в местах расположенных значительно выше уровня моря придётся стерилизовать дольше и при более высоком давлении, чтобы достигнуть того же эффекта. Ниже приведена сокращённая таблица показывающая зависимость между давлением и температурой, и изменение температуры закипания воды на различных высотах. Увеличивайте рекомендованное давление исходя из температуры кипения воды зависящей от вашего положения над уровнем моря. К примеру на высоте в 1,5 километра температура кипения воды снизится приблизительно на 5,5°C. Это значит что давление необходимо увеличить до 1.4 ат (20 psi), т.е. на 0,35 от рекомендуемых 1,05 ат (15 psi). Смотрите в таблице требуемое давление при изменении температуры на 5°C. (На самом деле температура остаётся прежней, а вот давление изменится).
прим.: таблицы позже, их надо пересчитать на человеческие единицы – метрические
http://sci.aha.ru/ALL/b17.htm – зависимость температуры кипения воды от давления
http://lulinalex.by.ru/Texts/Tourism/Pressure.htm – соответствие атмосферного давления высоте над уровнем моря и температуре кипения воды
Заметьте что эффект стерилизации получаемый при кипячении в течении 60 минут с давлением в 1,05 ат (15 psi) будет таким же от 30 минут с 2.1 ат (60 psi). Таким образом увеличение давления вдвое сократит время стерилизации вполовину. Но большинство скороварок не могут работать с таким давлением. Ещё некоторое время всё-таки стоит прибавить для достаточно хорошего проникновения пара в субстрат, особенно если используется большой и плотно загруженный автоклав.
После стерилизации поместите скороварку в лабораторию или комнату с условиями близкими к стерильным и до того как откроете дайте давлению в ней выровняться с атмосферным. Одним литром агара можно сполна залить 30 чашек Петри размером 100 x 15 мм. Способы разлива агара отличаются от грибовода к грибоводу. Если нужно разлить только одну или две стопки по десять чашек, их можно разложить на рабочем столе все рядом. Если необходимо приготовить больше чем две стопки или поверхность рабочего стола ограничена, тогда более удобно будет разливать перемещая чашки из стопки в стопку.
Перед разливом энергично взболтайте колбу с расплавленным агаром для равномерного распределения питательных веществ. Опытные культиваторы наполняют чашки в темпе и без перерывов. Если разливаемый агар всё ещё очень горячий, на крышке чашки Петри может образоваться конденсат. Чтобы уменьшить количество конденсата, можете подождать некоторое время перед тем как разливать агар. Если после того как давление выровняется скороварка постоит ещё 45 минут, то посуду с жидким носителем можно будет брать в руки не опасаясь обжечься.
От выбранного гриба можно получить два типа культуры : произвести новый мицелий из спор или клонировать живую ткань гриба. Каждый из способов даёт в результате жизнеспособный мицелий. У обоих способов есть свои преимущества и недостатки.